實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Real-timePCR，也叫qPCR，QuantitativePCR）是一種用于定量分析DNA或RNA樣品中目標(biāo)序列的方法。與傳統(tǒng)的PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）不同，實(shí)時(shí)PCR在PCR反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)實(shí)時(shí)定量目標(biāo)基因的擴(kuò)增量。其操作原理主要涉及以下幾個(gè)方面：
1.PCR基本原理
PCR是利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶在不同溫度下反復(fù)擴(kuò)增特定DNA序列的過(guò)程，包含以下幾個(gè)基本步驟：
變性（Denaturation）：將DNA模板加熱到高溫（一般為94-98°C），使DNA雙鏈分開，得到單鏈DNA。
退火（Annealing）：溫度降低（一般為50-65°C），使引物與單鏈DNA模板互補(bǔ)結(jié)合。
延伸（Extension）：溫度提高至聚合酶最適工作溫度（一般為72°C），聚合酶在引物的幫助下將游離的dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）加到DNA模板上，擴(kuò)增出新的DNA鏈。
2.實(shí)時(shí)PCR與傳統(tǒng)PCR的不同
傳統(tǒng)PCR僅在反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。而實(shí)時(shí)PCR則在擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)中，通過(guò)熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增的過(guò)程。實(shí)時(shí)熒光PCR具有高靈敏度和高特異性，能夠定量分析基因的表達(dá)量、突變、拷貝數(shù)等。
3.熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)
實(shí)時(shí)PCR通過(guò)熒光染料或探針的熒光信號(hào)來(lái)監(jiān)控DNA擴(kuò)增的過(guò)程。熒光信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)逐漸增加。
熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)的兩種主要方式：
SYBRGreen染料法：SYBRGreen是一種熒光染料，它能特異性地結(jié)合到雙鏈DNA上。當(dāng)SYBRGreen與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，會(huì)發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一個(gè)DNA片段，熒光強(qiáng)度就增加。
探針?lè)ǎ═aqMan探針?lè)ǎ菏褂锰囟ǖ臒晒鈽?biāo)記探針進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，探針通常由一個(gè)熒光染料和一個(gè)猝滅劑組成，只有在探針被聚合酶的5'→3'外切酶活性水解時(shí)，熒光染料才會(huì)被激發(fā)并釋放出信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)定量。
4.實(shí)時(shí)PCR的操作原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本操作原理是監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)隨著PCR擴(kuò)增過(guò)程中的變化來(lái)定量DNA或RNA的濃度。具體原理如下：
循環(huán)數(shù)與熒光信號(hào)：隨著PCR反應(yīng)進(jìn)行，每一輪擴(kuò)增都會(huì)增加目標(biāo)DNA的數(shù)量。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比。在早期擴(kuò)增階段，熒光信號(hào)較弱，但隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。
閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）：在PCR反應(yīng)中，熒光信號(hào)會(huì)在某一時(shí)刻超過(guò)設(shè)定的閾值（Threshold），此時(shí)的循環(huán)數(shù)即為Ct值（Cyclethreshold）。Ct值越小，表示目標(biāo)基因的初始量越多；Ct值越大，表示初始量越少。
5.定量分析過(guò)程
標(biāo)準(zhǔn)曲線法：通過(guò)構(gòu)建已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以將未知樣本的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，從而得到目標(biāo)基因的初始濃度。
ΔCt法：通過(guò)測(cè)量目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Ct值差異（ΔCt），進(jìn)而比較不同樣本中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。
ΔΔCt法：通過(guò)計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組之間的ΔCt差異（ΔΔCt），來(lái)分析目標(biāo)基因在不同條件下的表達(dá)變化。
6.實(shí)時(shí)PCR儀的構(gòu)成與工作流程
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀一般由以下部分組成：
熱循環(huán)模塊：用于加熱和冷卻樣本，使其在各個(gè)溫度階段進(jìn)行變性、退火、延伸等反應(yīng)。
熒光檢測(cè)模塊：檢測(cè)PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光變化。
數(shù)據(jù)分析軟件：通過(guò)分析熒光數(shù)據(jù)，自動(dòng)計(jì)算出Ct值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果輸出。
操作流程：
樣本準(zhǔn)備：將DNA或RNA模板、引物、熒光染料（或探針）、酶和緩沖液等混合，準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系。
加入反應(yīng)板：將反應(yīng)體系加入96孔板或其他適用的反應(yīng)板中，并在PCR儀中放置好。
啟動(dòng)反應(yīng)：設(shè)置合適的溫度循環(huán)程序，啟動(dòng)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。
數(shù)據(jù)采集：在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時(shí)，PCR儀會(huì)自動(dòng)記錄熒光信號(hào)，并生成實(shí)時(shí)熒光數(shù)據(jù)。
分析結(jié)果：根據(jù)熒光數(shù)據(jù)計(jì)算Ct值，并進(jìn)行相應(yīng)的定量分析。
7.總結(jié)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀利用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增的過(guò)程，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映PCR產(chǎn)物的量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的定量分析。其高靈敏度和高特異性使其成為基因表達(dá)分析、病原檢測(cè)、基因組研究等領(lǐng)域的重要工具。
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